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    公开号:WO1984003887A1
    申请号:PCT/JP1984/000147
    申请日:1984-03-29
    公开日:1984-10-11
    发明作者:Tetsuro Okabe；Seiji Sato；Tomoko Ogata；Kazumi Fujiwara；Nobuo Fujiyoshi
    申请人:Kyowa Hakko Kogyo Kk；Tetsuro Okabe；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 新 規 生 理 活 性 蛋 白 性 物 質
    [0002] 技 =術 分 野
    [0003] 本発明は、 D N A合成促進活性を示す新規生理活性蛋白性物質なら びに、 ヒ ト骨髄性白血病細胞株の培養による該物質の製造法に関する, 背 景 技 術
    [0004] 従来、 D N A合成促進活性を示す物質としては下記のごとき例が知 られている。
    [0005] (1) P D G F ( Platelet-derived growth factor )
    [0006] Proc. Natl. Acad. Sci. , 76, 1809 ( 1979 )
    [0007] (2) T G F ( Transforming growth factor )
    [0008] J. Biol. Chem. 257, 5220 (1982)
    [0009] (3) E G F ( Epidermal growth factor )
    [0010] Anal. Biachem._lll, 195 ( 1981 )
    [0011] (4) F G F ( Fibroblast growth factor )
    [0012] Ann. Rev. Biochem. 45 , 531 ( 1976 ) ,
    [0013] (5) F S L A ( Fibroblast Somatomedin like activi y )
    [0014] J. Cellular Physiology 107, 317 ( 1981 )
    [0015] (6) I G F - I ( Insulin 1 ike growth factor )
    [0016] J. Bndo.cr. 85 , 267 ( 1980 )
    [0017] (7) I G F - Π ( Insulin like growth factor )
    [0018] Diabetes 31 , 2823 ( 1982 ) '
    [0019] (8) M S A (Multiplication stimulating activity )
    [0020] Nature 272 ( 23 ) , 776 ( 1978 )
    [0021] これらの D N A合成促進活性物質は血清などの蛋白性物質を添加し た培地を用いて製造しているため、 培養細胞が生産した物質であるこ との同定が困難であり、 また培地成分との分離が困難であるなどの難
    [0022] Ο ΡΙ
    [0023] ノ 点があり、 いまだ実用的価値を有していない。
    [0024] 発 明 の 開 示
    [0025] 本発明者らは、 ヒ ト骨髄性白血病細胞を蛋白質を含まない培地を用 いて培養した場合、 培養上清中に， マウス線維芽細胞铢 3 T 3株、 お よびニヮ ト リ胎児線維芽細胞を用いた 3 H -チミ ジンの細胞内への取 込み実験の系において、 顕著にその取込みを促進し、 D M A合成を促 進する物質が存在することを見出し本発明を完成するに至った。
    [0026] 以下、 本発明を詳細に説明する。 ' 本発明は、 D N A合成促進活性を有する新規生理活性蛋白性物質を 提供する。
    [0027] 本発明物質は分子量 6, 3 0 0 ± 5 0 0を有するものと， 9, 0 0 0 1 3, 0 0 Qを有するものとの 2群に分けられ、 等電点によってさらに 次のとおりの種類に分けられる。
    [0028] 第 1 表
    [0029] Να 分 子 点 ( Ιρ )
    [0030] 1 9 200 + 500 8. 55 0. 1
    [0031] 2 10, 000 + 500 6. 9 + 0. 1
    [0032] 3 9, 400 + 500 8. 25 + 0. 1
    [0033] 4 10 000 + 500 6. 7 + 0. 1
    [0034] I 5 10, 500 土 500 5. 8 + 0. 1
    [0035] 6 10, 500 Τ 5.00 5. 6 0. 1
    [0036] 7 10 500 + 500 6. 09 + 0. 1
    [0037] 8 11, 000 + 500 4. 7 + 0. 1
    [0038] 9 11 800 + 500 4. 19 土 0. 1
    [0039] 10 12 800 土 500 3. 54 0. 1
    [0040] 11 6, 300 土 500 8. 0 士 0. 1
    [0041] 12 8. 4 0. 1
    [0042] I 13 8. 5 + 0. 1
    [0043] 14 9. 0 + ひ. 3
    [0044] 15 9. 6 + Q. 3
    [0045] ΟΜΡΙ
    [0046] ' WIPO Λ ' 本発明物質は、 デォキシリボ核酸分解酵素， リ ボ核酸分解酵素およ びノ イ ラ ミ ニダ一ゼによっては分解されず、 ト リプシン， キモ ト リプ シンなどの蛋白質分解酵素によって失活することから、 蛋白質も しく はぺプチ ド性の物質と考えられる。
    [0047] また、 本発明物質は、 ニヮ ト リ胎児線維芽細胞およびマウス線維芽 細胞株 3 T 3株への 3 H -チ ミ ジン取込みを促進し、 D N A合成促進 活性を有する。 さ らに本発明物質は、 マウス線維芽細胞株 3 T 3株の 増殖をも促進する。
    [0048] 前記した従来公知の活性物質の分子量， 等電点を比較のために示 すと下記のとおりである。 物 質 分 子 量 等電点 （ P i )
    [0049] P D G F 13， 000〜16， 000 9. 8
    [0050] T G F 7, 4 0 0
    [0051] E G F 6, 0 0 0 4. 5
    [0052] F G F 1 3, 0 0 0 9. 7
    [0053] F S L A 2 9. 0 0 0 4. 7
    [0054] 1 6, 5 0 0 6. 1〜 6. 3
    [0055] I G F - I 7, 6 4 9 8. 3
    [0056] I G F - E ' 7. 5 0 0 6. 5
    [0057] S A . 4 0, 0 0 0
    [0058] 2 0, 0 0 0
    [0059] 1 1, 0 0 0
    [0060] 7, 0 0 0 本発明物質には、 これら公知の物質の分子量， 等電点を有するもの はなく、 また起源も異なるので新規物質であることが明らかである。 本発明物質は、 ヒ ト骨髄性白血病細胞を培地に培養することにより、 主として培地上'清に生成， 蓄積されるので、 これを採取する。
    [0061] ヒ ト骨髄性白血病細胞としては、 本発明物質を生産するものなら、 いかなる株をも用いることができるが、 好適な一例として 5 6 2 - T 1株をあげることができる。 K 5 6 2 - T 1株は、 K 5 6 2株を胎 児子牛血清 1 0 %を舍有するハム F 1 0培地から順次血清濃度を低下 させ、 約 1年間の馴化期間を経た後、 得られた無蛋白培地馴化細胞で ある。 K 5 6 2株は、 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. , 76, 1293 (1979 ) , Blood, 45 , 321 ( 1975) , GANN 73 , 97 ( 1982) などに 記載されている公知の細胞株で一般的に入手可能な細胞株である。
    [0062] 培地としては、 ハム F 1 0培地, ハム F 1 2培地 （以上フ ロ ーラボ 钍製） ， ダルぺッコ M E M培地， M E M培地， R P M I — 1 6 4 0培 地 （以上日水製薬社製） .などの無蛋白培地およびそれらの混合培地が 用いられる。 培地には、 必要により、 グルタ ミ ン 0. 5〜 5 m M / tn 1 , 抗生物質 〔ペニシ リ ン （ 2 5 U / ml ) ， ス ト レプ ト マイ シン （ 2 5 μ g / ml ) など〕 ， 重曹 （ 0. 0 1 % ) などを適量加えてもよい。
    [0063] 培養には、 種々の培養ビン， シャ ーレ， ローラボ ト ル， ス ピンナー フラスコ ， ジャーフアーメ ンターなどを用いることができる。 培養は、 通常種細胞密度 5 X 1 0 4 〜 1 X 1 0 s 細胞/ mlとし、 3 0〜 4 0 で， 2〜4日間行うと、 各細胞密度に応じ、 本発明物質が主に培養液中に 生成する。 たとえば、 1 X 1 0 5 細胞/ mlの種細胞密度， 3 7で， 2 曰間の培養では、 培養液中に 3 0 0単位/ mlの活性物質が生成する。 培養物からの本発明物質の採取は次のとおり行う。 すなわち、 得ら れた培養液上清を、 凍結乾燥， 限外嫿過， 強酸性イ オ ン交換樹脂など を用いて濃縮する。 溶出には、 弱塩基性の緩衝液または低濃度のアル 力 リ溶液を用いる。 さらにゲル濾過法により、 培地由来の低分子物質 を除く。 ゲル濾過剤としては、 セフアデッ クス類 （フアルマシア · フ ァイ ン · ケミカル社製） ， バイォゲル類 （バイオラ ッ ド社製） ， コ ン ト ロール · ポア - グラ ス （ コ 一ニング ♦ グラス . ワークス社製） ， ト ョパール （東洋曹達社製） などを用いる。 本発明物質は、 高分子量で あるので、 分子量分画範囲を 1, 0 0 0〜5, 0 Q 0とすると生物活性測 定に影響する多くの低分子物質を除く ことができる。
    [0064] この操作によって、 活性画分は、 ほぼボイ ドボリ ウムの位置に分画 される。
    [0065] 活性画分の回収率は、 ほぼ 8 0 %であり、 2 8 0 n m , 2 6 0 n m , 3 4 0 n mの三波長測定により、 2 8 0 n mの値のみを算出し、 牛ァ ルブミ ンの 2 S 0 n mの吸収に換算すると、 比活性は、 ほぼ 2 0 0倍 に上昇する。 この活性画分を集め、 凍結乾燥により濃縮する。
    [0066] 次に活性画分を分子量によって分画するため、 バイォゲルまたはセ フアデックスを用い、 ゲル量に対し 1 / 1 0 0量の活性画分を通塔し、 溶出液 0.0 5 Mリ ン酸緩衝液を用いて流速 S V 0.1で溶出する。
    [0067] 活性画分は、 各分子量に応じ分離され、 三つの成分に分画される。 高分子側より画分 Ι , Π , ΠΙとすると、 ι : π : mの比率は、 7 ： 4 ： 3となり、 全活性の回収率は、 この工程では、 ぼぼ定量的に回収さ れ、 比活性は 7 2 0倍に上昇する。
    [0068] これらの活性画分を等電点分画するために、 Dowex 5 0 W X 8 (ダ ゥケ ミ カル社製） ， アンバーラ イ ト I R— 1 2 0 (バイ オラ ッ ド社製）， S K 1 0 2 (三菱化成社製） ， S P— Se.phadexC— 2 5 ( フ アルマ シ ァ · フ ァ イ ン · ケ ミ カル社製） などの強塩基性ィ ォン交換樹脂を用い 脱塩する。 p H 3〜 7の条件下吸着後、 蒸留水で水洗し、 0〜 3 N アンモニア水で溶出する。 この工程の回収率は、 3 0〜 5 0 %で各成 分の活性の比率は Ι : ΙΙ : ΙΠ = 7 : 2 : 3となる。
    [0069] 等電点電気泳動法は、 1 1 0 mlの L K B 8 1 0 0 ( L K B¾製スゥ ヱ一デン） カ ラムを用い、 両性電解質アンホラィ 卜の濃度を 1.9〜
    [0070] 0.6 2 5 %とし、 p H 3〜 1· 0の匂 Kを用いる。 4。Cに冷却し、
    [0071] 9 0 0 V , 1 0 m Aで 4 8時間の泳動を行い、 終了後、 フ ラ ク シ ョ ン コ レクタ一にて分画し、 各フラク ショ ンの p Hおよび活性を測定する。
    [0072] O PI この工程で、 Iの画分からは前記 I群に示した 5種類の活性部分、 Πの画分からは ]!群に示した 6種類の活性部分が得られ、 IEの画分か らは特徴的な活性部分を生じない。 各画分中のアンホラィ トは P D - 1 0カ ラ ム （ フ ア ルマシア · フ ァ イ ン ' ケミ カル社製 G— 2 5カ ラ ム ） を用いて除く。 この工程で回収率は 0.5〜2 %の最終回収率となり、 比活性は 3, 6 0 0〜 144 Q 0倍に上昇する。
    [0073] 本発明の生物活性の測定法を次にのべる。
    [0074] ① D N A合成促進能評価 ：
    [0075] A ) 3 T 3 — L 1細胞を用いる評価系 ：
    [0076] 培養容器としてヌ ンク社製 （デンマーク ） 2 4穴マイ クロプレー トを甩い、 グルタ ミ ン （ 0.2 9 mg /ml) ， 重曹 （ 0.1 % ) , ぺニシ リ ン （ 1 5単位 / ml ) ， ス ト レプ ト マイ シン （ 1 5 g / ml ) およ び熱不活化牛胎児血清 （ フ ローラ ボラ ト リ一社製） （ 1 0 %含むも のを I液、 0.4 %舍むものを Π液という ) を含むダルぺッコ ら変法 ィ ーグル培地 （ D E培地， 曰水製薬钍製） と、 3 T 3 - L 1細胞 ( A T C C - 9 2 , 大日本製薬社より入手） を用いて行う。
    [0077] 細胞懸濁液 （ 2 X 1 04 細胞/ ml) を I液で 5 %炭酸ガス含有空 気中、 3 7でで 5時間培養し、 Π液で培地変換して 2 4時間培養す る。 試料 0.1 mlを添加し、 さらに 1 6時間培養し、 3H -チ ミ ジン ( 0.5 C i / ml) を添加して 1時間培養する。 D N Aへの 3H― チ ミ ジ ンの取込み量を液体シンチ レイ シ ヨ ンカ ウ ンター （ァロカ社 製） にて測定する。
    [0078] B ) C E F ( Chick embryo fibroblast ) 細胞を用いる評価系 ： 培養容器は （ A ) と同じものを用いる。 グルタ ミ ン （ 0.2 9 mg/ ml) ， 重曹 （ 0.1 % ) ， ペニシ リ ン （ 1 5単位/ ml) ， ス ト レプ ト マイ シン （ 1 5 g / ml) および 0.4 Q 熟不活化牛胎児血清を含む ハム F 1 0培地 （ フ ロ ーラ ボラ ト リ 一社製） Π [液） と、 グルタ ミ ン （ 0.2 9 mg/ml) ， 重曹 （ 0.1 % ) を舍む M E M培地 ( 龍 ) を
    [0079] / ΟΜΡΪ 用い、 2代百 C E F細胞 （受精鶏卵を 1 2 曰孵卵後、 初代細胞を作 製し、 さらに 3日後に 2代目を作製） を用いて行う。
    [0080] 細胞懸濁液 （ 3.3 X 1 0 s 細胞/ ml) を IE液で 5 %炭酸ガス含有 空気中、 3 7でで 7 2時間培養し、 IV液で培地交換し、 試料を 0.1 ml添加し、 さらに （ A ) と同様の操作を行う。
    [0081] C ) 力価表示 ： .
    [0082] 力価は Biochemistry 4 (2), 1 6 9 ( 1972 ) に記載の方法に従 い、 イ ンシュ リ ン 1 0 0 n g / m 1の示す D N Aへの 3 H—チ ミ ジン の取込み能を 1.0 0 0単位として算出する。
    [0083] ② マウス 3 T 3細胞を用いる細胞増殖促進活性の測定法 ：
    [0084] 培養容器として、 ヌ ンク社製 （デンマーク ） 2 4穴マイ ク ロプレー トを用い、 グルタ ミ ン （ 0.2 9 mg/ml ) ， 重曹 （ 0.1 % ) ， ぺニシリ ン （ 1 5単位/ ml ) ， ス ト レプ トマイ シン （ 1 5 g / ml ) および熱 不活化牛胎児血清 （ 1 0 %を含むものを A液， 含まないものを B液と いう ） を含むダルべッ コ ら変法ィ ーグル培地 （ D N E培地， 曰水製薬 社製） と、 3 T 3 - L 1細胞を用いて行う。
    [0085] 細胞懸濁液 （ 3 X 1 04 細胞/ ml ) を A液で 5 %炭酸ガス含有空気 中、 3 7でで 4時間培養し、 B液で培地を交換し、 試料を 0.1 ml添加 し、—さらに 4 8時間培養後、 細胞数を測定する。.
    [0086] 各細胞に対する巾広い D N A合成促進作用'を有する本発明物質は、 また下記作用を有し、 種々の用途がある。
    [0087] 1 ) 抗体産生能を有する B細胞系の増殖を促進し、 免疫賦活剤と し て用いることが可能である。
    [0088] 2 ) 赤血球系細胞の増殖を促進することから貧血症への^用が可能
    [0089] C、め
    [0090] 3 ) 顆粒球， マクロフ ァージの増殖を促進し、 感染予防および免疫 賦活作用により抗癌作用が期待される。
    [0091] - 4 ) 繊維芽細胞の増殖を促進することから創傷の治療剤と して用い ることが可能である。 · ·
    [0092] 5 ) 抗瘙作用を示すといわれる Tumor Necrosis Factor等の生産細 胞の増殖を促進することから、 これらマクロファージ系細胞の増 殖因子として、 また、 イ ンタ ーフユ口ンを生産する繊維芽細胞， リ ンパ芽球系細胞などの増殖因子として、 無血清培地への添加効 果が期待できる。
    [0093] これ,らの作用効果は、 実施例 2および 3に示す。
    [0094] 図面の簡単な説明
    [0095] 第 1図は、 実施例 1中 (1)における本発明物質の溶出パターンを示す c 活性は 3H -チ ミ ジンの取込み促進活性を示す （以下同じ） 。
    [0096] 第 2図は、 実施例 1中 (2)における本発明物質の溶出パタ一ンを示す c 第 3図は、 I の等電点電気泳動図を示す。
    [0097] 第 4図は、 Πの等電点電気泳動図を示す。
    [0098] 第 5図は、 本発明物質の溶出パタ ーンで、 分子量マーカーとの比較 を示す。
    [0099] 第 6図は、 分子量と溶出位置の関係を示す。
    [0100] 第 7図は、 本発明物質の溶出パターンで、 分子量マーカーとの比较 を示す。
    [0101] 発明を実施するための最良の形態
    [0102] 実施例 1.
    [0103] (1) 骨髄性白血病細胞 K 5 6 2 - T 1株を種細胞として 3 7でで 4日 間静置培養し、 細胞上清を探取した。 培地はグルタ ミ ン （ 4mM)， ぺ ニシ リ ン （ 2 5 U /ml) , ス ト レプ ト マイ シン （ 2 5 g /ml) ， 重曹 （ 0. 0 1 % ) を加えたハム F 1 0 ¾地 （無蛋白培地） を用いた < 採取した細胞上清 （ 3, 0 0 O ml) を遠心分離 （ 6. 0 0 0 r p m , 1 0分間） し、 上清 （ 3, 0 0 0 ml) を凍結乾燥した。 ―
    [0104] 乾嫫粉末 （約 3 0 g ) を蒸留水 （ 4 3 ml) に溶解し、 細胞上清の 7 0倍の濃度になるように合わせた。 これを、 Biogel P - 6 (バ び ィオラ ッ ド社製） でゲル濾過した。 試料はゲル量の 1 / 2 0 ( W / V ) とし、 溶出は 0.0 5 M リ ン酸緩衝液 （ p H 7.0 ) で S V 0.1の 流速で行う。 分画は 1 0 mlずつ回収した。
    [0105] 溶出パク一ンを第 1図に示す。
    [0106] 低分子物質は、 ほぼ完全に除去され、 ボイ ドボリ ウム （ V o ) 附 近に 3H -チ ミ ジンの取込み促進活性が出現する。 この活性画分は マウス 3 T 3 - L 1細胞株の増殖促進効果を合せ持っており、 その 効果は、 試料を加えない場合の 2.3倍の細胞数増殖を示した。
    [0107] 回収率 8.0 % , 比活性は、 島津分光光度計 U V 2' 4 0を用いた 2 6 0 n m , 2 8 0 n ra , 3 4 0 η mの三波長差吸光度より、 2 8 0 n mの吸収を牛アルブミ ン量に換算した蛋白量と して求めた結果、 2 1 0倍に上昇した。
    [0108] (2) 上記活性画分 6 0 mlを集め、 凍結乾燥後、 さ らに同様にして Biogel P - 6 0 (バイオラ ッ ド社製） で分画した。 すなわち試料 1 4 0 rag を 4 mlの蒸留水に溶解し、 1 0 0 mlのカ ラムに充塡した Biogel P
    [0109] - 6 0に通塔した。 溶出は 0.0 5 M リ ン酸緩衝液 （ p H 7.0 ) で S V 0.1の流速で行う。 分画は、 3mlずつ回収した。
    [0110] 溶出パタ一ンを第 2図に示す。
    [0111] 活性画分は 3つに分かれ、 V 0附近の高分子不純物と分離するこ とができる。 三活性画分は合わせて、 ほぼ定量的に溶出され、 比活 性は 7 2 0倍に上昇した。 高分子側より、 それぞれ I ， Π， III と 名づけたこれら活性画分の活性比率は 7 ： 4 ： 3となり、 比活性は ほとんど同じであった。
    [0112] (3) 上記活性画分 I , H， IE， それぞれ 2 4 ml， 1 2ml, 1 2 mlを強 酸性ィ ォン交換樹脂 Dowex 5 0 W x 8 ( N a + 型ダウケ ミ カル社 製） 1 mlを充填したカ ラムに通塔し、 蒸留水 1 5 miで水洗し、 2 5 mlの蒸留水と 2 5 mlの 0.3 Nァンモニァ水を用いた直線濃度句配法 より溶出した。 この操作で塩類は、 ほぼ完全に除去される。 '活性画分は、 溶出後、 凍結乾燥によってアンモニアを除去した。
    [0113] I I m
    [0114] 回収率 2 0 % 9 % 1 %
    [0115] 比活性 3, 6 0 0 1 4. 4 0 0 5, 0 Q 0
    [0116] (4) 上記各成分を 8 1 0 0 - 1 カ ラ ム （ L K B钍製） ， p H 3〜 1 0 の両性電解質ァンホライ ト ， 1. 9〜0. 6 2 5 %を用いて各成分の等 電点を求めた。 1 1 0 m l力ラムの底部の陽極液に 1. 0 M リ ン酸， 頂 部の陰極液に 1 %エチレンジアミ ンを入れ、 匂配混合機を用い 5 0 %〜 5 %の濃度匂配とした。 9 0 0 ボルト ， 4 8時間， 4でで泳動 を行い、 分離後、 1 m lずつフラク シヨ ンコ レクタ一に分画し、 p H を測定した。 生物活性は、 P D - 1 ひカ ラ ム （ フ アルマシァ · ブァ イ ン · ケミカル社製 G— 2 5カラム） を用い、 アンホラィ トを分離 後測定した。
    [0117] I ， Πの等電点電気泳動図を第 3図および第 4図にそれぞれ示す。 この結果、 Iの P I値は、 8. 5 5 ， 6. 9 , 8. 2 5 ， 6. 7 , 5. 8 , 5. 6 ， 6. 0 9 ， 4. 7 , 4. 1 9 , 3. 5 4を示し、 Πの p I値は、 8. 0 ， 8. 4 , 8. 5 , 9. 0 , 9. 6を示した。 従って、 I ， Πは類似の分子量 でァミ ノ酸組成の異なった生 S活性蛋白性物質の混合物であると考 元られる。
    [0118] DIには特徴的なピークが見られなかった。
    [0119] (5) 上記 (2)で得られた活性画分を凍結乾燥後 0. 0 5 M リ ン酸緩衝液
    [0120] ( p H 7. 0 ) に 1 5, 0 0 0 U / mlの割合でとかし、 セフアデッ クス G - 5 0 ( フ ァ ルマシァ ♦ フ ァ イ ン ' ケミカルネ土製） 1 0 0 m lを充 塡した内径 1. 5 cmの力ラムに通塔した。 溶出は， 0. 0 5 M リ ン酸緩 衝液 （ P H 7. 0 ) で S V 0. 0 5の流速で行った。
    [0121] 分子量マーカ一としては、 V 0値を求めるために 3 nig / m lの τ― グロブリ ン （分子量 160, 000 ) , 3 rag / m lのチ トク一ロム C (分子
    [0122] OMPI 量 12, 500 ) , S rng/mlのィ ンシュ リ ン （分子量 5, 700 ) ， および 3 mg / mlのバシ ト ラ シン （分子量 1， 450) を用いた。 なお、 イ ンシ ュ リ ンは、 中性条件下では溶解度が低いため、 0. 1 N酢酸で溶出し た。 各マーカ一の溶出位置は、 2 8 0 n mの吸光度から求めた。
    [0123] 結果を第 5図に示す。 溶出位置から分子量を求
    [0124] めるために分子量と溶出位置の関係を示したのが
    [0125] 第 6図である。 これらマーカーは、 片対数グラフ
    [0126] 上、 直線上に位置する。
    [0127] 活性画分 I は 9,.0 0 0〜 1 3, 0 0 0 ， Πは 6, 3 0 0 ± 5 0 0 , Π は 2, 4 0 0 ± 5 0 0の分子量を示した。
    [0128] 以上の結果、 活性画分には第 1表記載の少なく とも 1 5成分が舍 まれていることがわかる。
    [0129] (6) 上記 (5)で得られた活性画分 Iを、 それぞれの分子量を決定するた
    [0130] めに高速液体ク 口マ トグラフィ一を用い、 ゲル濾過を行った。 高速 液体ク ロマ ト グラ フィ ーは、 B E C K M A N H P L C 3 4 2 (ぺ ッ クマン社製） を用い、 ゲル濾過力 ラムと して、 T S K - G P C力 ラム G — 3, 0 0 0 S W ( 7. 5 x 6 0 0 cm ) (東洋曹達社製） を用 いた。 溶媒として、 0. 1 5 M食塩， 0. 0 2 M酢酸ソ一ダを 1 ： 1 に 混合したものを P H 6. 0.で用いた。 分子量マ一カーと しては、 0. 1 mg / 0. 2 mlのチ ト ク ローム C (分子量 1 2, 5 0 0 ) , 0. 1 mg / 0. 2 mlの ト リ プシ ンィ ン ヒ ビター （分子量 2 1. 5 0 0 ) .， 0. 1 mg / 0. 2 mlのアポロチニ ン （分子量 6, 5 0 0 ) を用いた。 各マ一力一は、 そ の溶出位置より、 対数グラフ上、 直線上に位置した。 各分画成分を、 それぞれゲル濾過したところ、 セフ アデッ クス G - 5 0によつて高 分子側に現れた成分は、 次の様な分子量を与えた。
    [0131] OMPI WIPO ,、V, 分 子 等 ハ.、、 UP)
    [0132] 1 9, 200 土 500 8.55 土 0.1
    [0133] 2 10， 000 土 500 6.9 土 0.1
    [0134] 3 9， 400 土 500 8.25 土 0.1
    [0135] 4 10， 000 士 500 6.7 丄 0.1
    [0136] I 5 10， 500 士 500 5.8 土 0.1
    [0137] 6 10， 500 土 500 5.6 " 丄 0.1
    [0138] 7 10, 500 土 500 6.09 土 0.1
    [0139] 8 ' 11, 000 土 500 4.7 土 0.1
    [0140] 9 11, 800 土 500 4.19 土 0.1
    [0141] 10 12, 800 土 500 3.54 土 0.1
    [0142] (7) 上記 (5)で得られた活性画分 Πの I p値 8.4 , 9.0 ， 9.6の成分に ついて高速液体ク口マ トグラフィ一を用いて分子量を確認した。
    [0143] S H I M A D Z U H P L C , L C - 4 Aを用い、 ゲル濾過用 H S G - 3 0 W力ラムにより分析した。 検出には U V 2 8 0 n mで測定 し、 試料 2 0 i を注入した。 溶出液として 0.1 M K H 2 P〇 ， 0.1 N a 2 H P 0 , 0.1 M N a 2 S 04 の緩衝液 （ P H 6.8 ) を用い、 0.7 ml/分で行った。 分子量マーカーとして 0.2 mg /mlのアルブミ ン （分子量 6 9, 0 0 0 》 τ ォブアルブミ ン （分子量 45, 0 0 0 ) , チ ト クロ一厶（： （分子量 1 2.5 0 0 ) , イ ンシユ リ ン （分子量 5, 7 0 0 ) を用い、 第 7図に示す狯量線を得た。
    [0144] その結果、 各成分はいずれも 6, 0 0 0の分子量を示した。
    [0145] 実施例 2.
    [0146] ヒ ト リ ンパ芽球細胞に对する D Ν Α合成促進作用
    [0147] 実施例 1で得られた活性画分 Iを用いて、 バーキッ ト ンパ腫由来 リ ンパ芽球細胞ナマルバ株に射する D N A合成促進活性を調べた。
    [0148] ナマルバ株を、 二ッ スィ社製 R P I - 1 6 4 0培地にグルタ ミ ン
    [0149] O PI ( 4 m M ) ； ス ト レプ ト マイ シ ン （ 2 5 g / m 1 ) ， ペニシ リ ン 2 5 1； / 1111 ) , へぺス （ 1 0 01 ^1 ) , 重曹 （ 0. 0 1 % ) および仔牛血 清 （ 1 0 % ) を加えた培地で 3 7 でで培養後、 細胞を遠心して集め、 5 X 1 0 5 細胞/' mlの濃度で上記培地から仔牛血清を除いた培地に懸 蜀し、 2 4穴マルチディ ッ シュプレー ト に分注し、 3 7 :で培養した, 3 日後、 新鮮な培地に交換し、 2 日間 3 7 でで培養し、 再び液を交換 し、 サンプル (活性画分 I の希釈物） および比較サンプル （ PCS,ィ ン シュ リ ン ） を添加した。 6時間、 3 7 °Cで培養後、 ト リチウムチミ ジ ン 0. 5 ^Ci/wellになる様に加え、 常法により、 その取込み活性を測 定した。 測定値は、 2回の実験の平均値を示した。
    [0150] 実施例 3.
    [0151] ヒ ト白血病細胞株に対する D N A合成促進活性
    [0152] 実施例 1で得られた活性画分 I.を用いて.、 各種白血病細胞株に対す る D N A合成促進能を調べた。
    [0153] K 5 6 2株は、 ヒ ト骨髄性白血病細胞株として Blood 45, 321 (1975) に記載された赤血球系へ分化すると考えられている未熟な白血病細胞 株である。 M L - 1株は、 Cancer Res, , 42 5152- 5158 (1982)に急性 骨髄性白血病 （ myeloblast) 細胞株と して樹立され、 マク ロフ ァ ージ 単球へと分化すると考えられている。 U - 9 3 7株は ATCC CRL 1593 に登録された ヒ ト組織球性白血病細胞株で単球様細胞株である。 THP - 1株は Int. J. Cancer 26 171- 176 (1982)に ヒ ト急性単球性白血病細胞 として記載された株でマクロ フ ァ ジへ分化すると考えられている。 これらの一連の分化過程にあると考えられる細胞株に対ずる作用を次 の方法に従って D N A合成促進活性を測定した。
    [0154] いずれの細胞株も、 日水製薬社製 R P M I - 1 6 4 0培地にグルタ ミ ン （ 4 m M ) ， ス ト レプ ト マイ シン （ 2 5 g/m 1 ) ， ペニシ リ ン ( 2 5 U/ml) ， へぺス （ 1 0 mM) ， 重曹 （ 0.0 '1 % ) を含む培地に脍 児小牛血清 （ 5 % ) を加えた培地で 3 7 °Cで培養後、 細胞を上記の血 清を含まない培地に懸濁して、 1 X 104 細胞/ wellとなる様に： 9 8穴 マイ クロタイタープレートに分注した。
    [0155] M L — 1および U— 9 3 7は 2 4時間、 K 5 6 2および T H P— 1は 3 曰間上記の無血清 ¾地で採取した各濃度のサンプルを 10^ 1 加え、 16〜20時間培養後、 0. 1 Ciの ト リ チウ ムチ ミ ジンを加え、 8時間、 パルス ラ ペルを行った。 ラ ペル後、 細胞をオー トハーべスターを用い 濾紙上に集め、 フィルタ一を 3 mlの P B S (水 5 ^に Nacl 40g, KCL 1 g, Na2HP04 5.75gおよび KH2P04 I を含むリ ン酸バッファー溶液） で洗浄し、 さらに 5 % ト リ クロル酢酸およびァセ ト ンで洗浄し、 赤 線ラ ンプで乾燥させ、 常法に従って、 そのチ ミ ジン取込みを測定した, なお、 いずれも 3回の実験の平均値をもって下記に示した。
    [0156]
    权利要求:
    Claims 請. 求 の 範 囲
    (1) 骨髄性白血病細胞株が生産する， D N A合成促進活性を示す新規 生理活性蛋白性物質。
    (2) 骨髄白血病細胞株を無蛋白培地に培養し、 培養物中に D N A合成 促進活性を示す生理活性蛋白質を蓄積せしめ、 該培養物から該蛋白 質を採取す ¾ことを特徵とする新規生理活性蛋白性物質の製造法。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE3481420D1|1990-04-05|
    EP0143850A1|1985-06-12|
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    JPS59181293A|1984-10-15|
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1984-10-11| AK| Designated states|Designated state(s): AU US |
    1984-10-11| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): BE CH DE FR GB NL SE |
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    1985-06-12| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1984901399 Country of ref document: EP |
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    优先权:
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